專家技術經驗交流區.幹細胞的製造工藝

2022/03/24 23,708

撰文/陳世棟醫師;整理/編輯部

我們談到幹細胞,無可避免的一定要談到幹細胞的製作流程,一般主流的幹細胞來源都是以臍帶為主,今天就給大家聊聊臍帶間充質幹細胞的基本流程,包括了供體的確定和幹細胞的製備工藝。


儲存臍帶幹細胞的前置作業有哪些?

首先,供體的確定,主要的是選擇產婦和胎兒兩部份,產婦的部份是牽涉到產婦的篩選,一般來說,希望產婦年齡低於38週歲,無家族遺傳病史、無惡性腫瘤及代謝疾病,在懷孕期間各項的檢驗數據都是正常的,有關的病原微生物血清學檢查,包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎,EBV、CMV、HIV和TP,梅毒帶原者、肝臟的轉氨酶高者、各種結核病患者、吸毒史者、同性戀者、多個性伴侶者等高危人群。對於胎兒的部份,則有以下要求,包括活胎、足月、無畸型和各項生理指標符合懷孕週期的標準。

 

擇臍帶幹細胞要如何提取與儲存呢?

接下來就是細胞的製備工藝流程,包括了組織的採集,細胞分離、細胞凍存和細胞製劑。臍帶接收後,必須要預處理,包括了生理鹽水的沖洗和雙抗浸泡,然後去除血管,去除包膜,將組織分離成適當大小,置入無菌EP管內,充分剪碎,利用無血清培養基進行原代培養,培養約兩週,進行傳代培養P0~P1,再經歷3~4天,再一次傳代培養P1~P2,之後凍存於細胞庫。每一次的傳代後都必須過形態觀察,存活率檢檢測、細真菌檢、支原體檢測、內毒素檢測、細胞表型檢測。凍存到細胞庫之前也必須做細胞內核型分析、種屬鑒別、STR分析、生長曲線、群體倍增時間、細胞周期、分化潛能、免疫學反應、致瘤實驗、端粒酶活性檢測。

接下來就是對於臍帶間充質幹細胞的鑒定,主要有細胞形態學、細胞表面標誌物、細胞成脂誘首分化、細胞成股誘導分化、細胞成軟骨誘導分化。細胞形態學是從培養箱中取出培養了3天原代細胞和傳代2~3天的P1幹細胞,在顯微鏡下進行大體的觀察、初步判斷有無污染、細胞形態是否正常。如果正常則再用高倍鏡對細胞的大小、形態、胞漿透明度、細胞核及核仁、胞漿中是否有異常顆粒進行判斷。如果沒有問題,則再次確認相關細胞結構有無問題,然後再拍照存檔。如果有污染發生,應即移除培養室並做好登記,註明污染類型信息,查找原因。

除了代數培養外,我們也要對細胞的表面標誌物進行檢測,將處於對數生長期的臍帶間充質幹細胞進行胰酶消化,調整細胞濃度後對不同的組別包括陰性對照組、同型對照組還有試驗組進行處理,最後用流式細胞儀檢測各標誌物的表達百分比。同時為了檢測臍帶間充質幹細胞的均一性、純度、穩定性和存活率、細胞群體倍增時間、細胞周期分析、細胞核型分析,細胞端粒酶活性檢測、有效性、安全性、無菌試驗、支原體檢測、細胞內外源致病因子檢測、內毒素檢測、體外成瘤試驗及體內成瘤試驗,都須要花大量的時間才能將一個幹細胞完整安全的製作出來。

臍帶間充質幹細胞做為抗衰老的主要治療手段,已經進人一個快速增長的時期,主要是因為經濟發達、知識和教育的普及和快速傳播,人們對這項治療已經是耳熟能詳,加上普遍的人均夀命的延長,讓大家對於健康的老化有了更高的期望,因此,這個賽道或是產業絕對是未來有大爆發和大未來的,不僅是在抗衰老上,在醫美整形的領域和美容保養品上,都是大家可期竹,僅以個人淺薄的知識介紹幹細胞的工藝,望各位專家和同道們不吝指教。

 

陳世棟 醫師

從事醫療工作多年,是義大利DEKA公司激光溶脂國際訓練講師及以色列ALMA(深藍)國際訓練講師,為中國整形美容外科學全書《微創美容外科學》編者之一,也是台灣美容醫學醫學會理事及美容外科教育長,長期從事醫學美容臨床及教學工作。本身有外科、內科及醫學工程專業背景,專研於先進的醫美技術開發,在激光溶脂、自體脂肪移植、幹細胞治療、端粒酶抗衰老治療及複合式無痕微整形等都有非常精湛的研究。